Per anni, se avessi chiesto a uno scienziato come immaginavano il funzionamento interno di una cellula, avrebbero potuto parlare di una fabbrica altamente organizzata, con diversi reparti che svolgono ciascuno compiti specializzati in linee di montaggio delineate.
Chiedi ora e potrebbero essere piu inclini a confrontare la cella con un caotico ufficio open space, con zone di hot desking in cui diversi tipi di materia cellulare si riuniscono per completare un compito e poi si disperdono in altre regioni.
Ovunque gli scienziati guardino nelle cellule, schiere di proteine ​​e RNA sembrano attaccarsi insieme, fondendosi in goccioline simili a perle distinte dall’ambiente circostante. Questi compartimenti dinamici consentono alle cellule di svolgere funzioni essenziali, che vanno dal controllo genico e la riparazione del DNA allo smaltimento dei rifiuti e alle risposte allo stress. Sono spesso fugaci e non sono ostacolati da una membrana che li racchiude, a differenza di molti altri componenti cellulari, come i mitocondri, che sono legati alla membrana. Quando una goccia non e piu necessaria, svanisce.
Queste sfere transitorie sono create da un processo chiamato separazione di fase, che coinvolge gruppi di molecole che si segregano a causa delle differenze nella loro densita o nel modo in cui interagiscono. L’idea e diventata popolare tra i biologi una decina di anni fa, con il numero di pubblicazioni rilevanti in aumento di circa il 50% ogni anno dal 2017 circa. I biologi hanno invocato la separazione di fase per spiegare aspetti di come si sviluppano gli embrioni, come comunicano i neuroni, come il sistema immunitario si difende dai microrganismi , e altro ancora. E quando il processo va storto, sembrano seguire malattie dal cancro e dal diabete al disturbo dello spettro autistico e alla neurodegenerazione. L’industria farmaceutica sta gia esplorando come indirizzare i condensati come percorso verso nuovi trattamenti,
Ma ora il campo e a un bivio. Dopo una corsa iniziale per documentare il fenomeno in ogni angolo della cellula, gli scienziati stanno iniziando a porre domande piu dettagliate. Vogliono sapere cosa stanno facendo questi globuli, come si formano e, soprattutto, come dimostrare che questi organelli privi di membrana – o “condensati biomolecolari” come sono stati conosciuti – sono davvero tanto diffusi ed essenziali per la cellula quanto molti rapporti hanno affermato. I ricercatori stanno anche rispondendo ai critici che hanno messo in dubbio l’accuratezza di alcune descrizioni della separazione di fase nelle cellule, sostenendo che altre forze oltre alla separazione di fase potrebbero aver creato goccioline. Ma molti biologi non hanno bisogno di convincere.
“Abbiamo le osservazioni che si formano i condensati”, afferma Jonathon Ditlev, un biofisico cellulare presso l’Hospital for Sick Children di Toronto, in Canada. “Ora dobbiamo mostrare perche sono importanti”.
Forma e funzione
La massima progettuale che “la forma segue la funzione” presuppone che gli oggetti siano costruiti per servire uno scopo particolare. Sebbene funzioni per gli architetti, puo creare un enigma per i biologi, che devono decodificare un’entita per dedurre a cosa serve.
I condensati sono disponibili in tutte le forme e dimensioni, da minuscole sfere delle dimensioni di un virus a strutture piu complesse paragonabili ai batteri. La funzione principale che gli scienziati propongono per tutte queste goccioline separate in fase e quella di crogioli molecolari. Concentrando i componenti in un punto della cellula, le goccioline possono accelerare i processi biochimici, nonche separare i reagenti l’uno dall’altro per prevenire interazioni indesiderate. Eppure questa linea di ragionamento e stata nel migliore dei casi inferenziale, nel peggiore dei casi speculativa.
“Ci sono molti processi biologici fondamentali in cui ci sono documenti che affermano che la separazione di fase gioca un ruolo”, afferma Tanja Mittag, biologa strutturale presso il St. Jude Children’s Research Hospital di Memphis, nel Tennessee. Ma, sottolinea: “Questo non e stato mostrato in modo rigoroso, quindi penso che questo debba essere risolto”.
Per fare cio, gli scienziati devono comprendere non solo la popolazione di molecole che si raggruppano in una gocciolina, ma anche come lavorano al suo interno. Solo allora i ricercatori possono iniziare a raccogliere informazioni sul perche tali goccioline potrebbero prendere forma in primo luogo.
Dal punto di vista di Mittag, la cosa piu vicina a chiunque sia arrivato a dimostrare in modo convincente lo scopo di un condensato e un esperimento del biochimico Mike Rosen presso il Southwestern Medical Center dell’Universita del Texas a Dallas. L’anno scorso, lui e William Peeples, un suo ex studente laureato, hanno mostrato come la cinetica di un gruppo di enzimi potrebbe essere accelerata attraverso la separazione di fase1. Hanno usato un sistema in cui potevano guardare le goccioline in 3D. Al di fuori dei condensati, le reazioni enzimatiche progredivano a un ritmo lento e costante; all’interno, il tasso di attivita era circa 36 volte piu veloce.
L’aumento delle concentrazioni locali di questi enzimi e delle loro molecole partner spiegava in parte i dati, come avevano dimostrato altri gruppi. Ma i ricercatori hanno anche scoperto che i condensati davano al processo una struttura extra: aiutavano a organizzare gli enzimi nello spazio, fornendo uno “scaffold” molecolare in modo che potessero collaborare piu facilmente con i loro reagenti. Una piccola quantita di reagente e poi andata ulteriormente verso l’accelerazione dell’azione enzimatica, consentendo una maggiore efficienza catalitica complessiva. Uno studio indipendente pubblicato a settembre ha dimostrato questo stesso effetto di impalcatura con un’ampia gamma di enzimi2.
“Si ottiene questo effetto combinato di aumento dell’efficienza e aumento della concentrazione”, afferma Peeples, che ora lavora per una societa di biotecnologie in fase iniziale affiliata a Flagship Pioneering, un’azienda di innovazione nel campo delle scienze della vita con sede a Cambridge, nel Massachusetts. O, in altre parole, Peeples dice: “Hai un doppio”.
Costruisci
Un altro approccio per capire meglio come funziona qualcosa e costruirlo da zero. Nel 2020, tre gruppi di ricerca indipendenti hanno fatto proprio questo con un tipo specializzato di condensato noto come granulo di stress3–5.
Queste bolle di stoccaggio contengono proteine ​​​​e RNA e si formano in risposta a difficolta cellulari o ambientali, aiutando a sequestrare e proteggere strumenti cellulari cruciali fino a quando le condizioni non migliorano. Ma proprio come un guardaroba disordinato puo creare pericolose quantita di polvere o diventare un pericolo di incendio in casa, cosi anche i granuli di stress possono causare danni nella cella se non vengono eliminati in modo tempestivo.
Gli scienziati avevano precedentemente studiato come funzionano le goccioline separate da fasi, fabbricandone versioni semplici e modificando i condensati naturali nelle cellule utilizzando inibitori di farmaci e strumenti genetici, per esaminare cosa succede se vengono disturbati. Ma i tre gruppi sono stati i primi a cucire insieme fedelmente repliche di condensa dal basso verso l’alto. Utilizzando una combinazione di tecniche sperimentali, teoria e simulazioni atomiche dettagliate, hanno decifrato molte delle regole biofisiche che regolano la formazione del condensato.
Ad esempio, hanno mostrato come una particolare proteina dell’impalcatura sembra essere l’epicentro dell’assemblaggio dei granuli di stress. Quando la cellula incontra avversita, questa proteina, chiamata G3BP1, cambia forma, spingendo le molecole di RNA vicine a collegarsi con essa e promuovere il raggruppamento. Potenziati da questa intuizione meccanicistica chiave, i ricercatori stanno ora iniziando a sondare come questi compartimenti si formano e si frammentano dinamicamente e quali molecole guidano ciascuna parte del loro ciclo di vita.
“Questo e il potere della ricostituzione in vitro”, afferma Peiguo Yang, biologo cellulare della Westlake University di Hangzhou, in Cina, che ha lavorato a uno degli studi3.
Da allora un altro dei team ha esplorato, in un lavoro non pubblicato, come le proteine ​​legate alla malattia influiscono sui condensati. I condensati di solito hanno una consistenza spugnosa. Ma in presenza di queste proteine, le strutture diventano piu rigide, portando ai tipi di grumi proteici nelle cellule che sono alla base di molti disturbi neurodegenerativi. “Possiamo effettivamente vedere l’aggregazione all’interno dei granuli che abbiamo costruito”, afferma Simon Alberti, biochimico dell’Universita tecnica di Dresda in Germania, che ha costruito i granuli.
In transizione
Sforzi come questi dovrebbero fare molto per risolvere una delle piu grandi controversie nel campo del condensato: come si formano esattamente.
Gran parte delle prove che queste macchie sono create dalla separazione di fase proviene da esperimenti in provetta che potrebbero non riflettere le condizioni nelle cellule viventi, osserva Amy Gladfelter, biologa cellulare dell’Universita della Carolina del Nord, a Chapel Hill, soprattutto perche questi condensati sono ordini di grandezza maggiore delle loro controparti naturali. “Siamo stati attirati a studiare queste goccioline grandi e molto succulente che sono macroscopiche e carismatiche”, ha detto in un incontro online. Tenuto per discutere di questioni aperte e sfide nella biologia del condensato, e stato convocato dalla Fondazione di ricerca tedesca (DFG) e dal Center for Biomolecular Condensates, lanciato di recente, alla Washington University di St. Louis, Missouri, a fine ottobre.
Ma molte funzioni cruciali potrebbero verificarsi su scale che gli scienziati non possono vedere. I ricercatori non sono d’accordo anche sui meccanismi precisi attraverso i quali le molecole potrebbero concentrarsi in compartimenti privi di membrana e questi processi sono difficili da vedere anche con la migliore tecnologia. Quindi, sebbene i biologi abbiano passato l’ultimo decennio a vedere condensati dappertutto – negli esperimenti in provetta, nelle cellule e nei modelli animali – alcuni critici temono che molte di queste osservazioni possano rivelarsi miraggi.
Parte della sfida di capire se un blob e un prodotto della separazione di fase e l’ampia variazione nel modo in cui appaiono e di cosa sono fatti. Nel loro importante documento del 20096, il primo a identificare blob fluidi e separati in fase, il biologo cellulare Tony Hyman presso il Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics di Dresda e il biofisico Cliff Brangwynne, ora alla Princeton University nel New Jersey, ha descritto corpi di RNA e proteine ​​che si uniscono e si rompono come perle d’acqua su una lastra di vetro.
“Sembravano simili a gocce liquide che bagnavano una superficie”, hanno scritto gli autori. (Hyman e Brangwynne hanno vinto il prestigioso Breakthrough Prize in Life Sciences 2023 per questo lavoro.)
I ricercatori hanno attribuito il fenomeno alla “separazione di fase liquido-liquido” (LLPS), un processo di demiscelazione analogo all’ingrossamento delle goccioline di olio sospese nell’aceto. LLPS sembrava essere ovunque nella cellula: nei piccoli corpi nel nucleo, nei siti di attivita genica e nelle strutture coinvolte nella divisione cellulare (vedi “Una folla di condensati”).
Ma alcuni di questi blob si comportavano piu come solidi che come liquidi, oppure assumevano una consistenza appiccicosa e gelatinosa. Rendendosi conto che era in gioco una biofisica piu complessa della semplice separazione dei liquidi, nel 2017 Hyman e Rosen hanno coniato7 un nome generico per questi compartimenti: condensati biomolecolari. Il nome ha lasciato aperto il modo in cui questi assemblaggi di proteine ​​​​e acidi nucleici hanno preso forma o si sono disfatti. “Doveva deliberatamente essere privo di meccanismi”, spiega Rosen.
Oltre al processo di demiscelazione dell’olio e dell’aceto, sono importanti anche le interazioni fisiche e chimiche tra parti specifiche di queste strutture in rete. Ad esempio, un punto caldo dell’assemblaggio del condensato risulta essere costituito da frammenti di proteine ​​traballanti privi di strutture 3D stabili e che interagiscono con altre molecole e solventi per guidare la separazione di fase. Ulteriori esperimenti e teorie hanno mostrato che un numero enorme di forze lavora insieme per creare condensati.
Alcuni nella comunita hanno cercato di iniettare precisione nel campo e guidare i ricercatori a scoprire se un blob si forma attraverso la separazione di fase o in qualche altro modo.
Mittag e il biofisico computazionale Rohit Pappu, direttore del centro condensati della Washington University, hanno messo insieme un quadro che stabilisce come verificare che un condensato sia realmente presente, inclusa la differenza di densita all’interno e all’esterno di un blob e la reticolazione fisica tra le molecole all’interno8. E hanno suggerito modi per testare la separazione di fase, come esperimenti progettati per mostrare le soglie di concentrazione al di sopra delle quali si formano le goccioline, a causa delle transizioni di densita o delle interazioni fisiche, o di entrambe.
Secondo Mittag, questa definizione piu formale del processo e un “passo avanti davvero importante in termini di comprensione concettuale della separazione di fase”. Ma, riconosce, ha anche alzato il livello scientifico in un modo che sta creando piu domande. “E cosi, alla fine”, dice Mittag, “in realta penso che non abbiamo davvero superato le controversie”.
Un passaggio critico
Gran parte di quel respingimento e venuto da Robert Tjian, un biochimico dell’Universita della California, a Berkeley. Nel 2019, lui e i suoi colleghi hanno pubblicato un commento ampiamente letto9 che metteva in dubbio il rigore scientifico del campo, una critica resa piu risonante da un articolo di notizie sulla rivista Science.
Tjian dice di apprezzare cio che scienziati come Mittag e Pappu stanno facendo per affrontare le sue preoccupazioni. E accoglie con favore l’andare oltre le spiegazioni semplicistiche. “Questo ovviamente e ancora un campo piuttosto complesso e mal definito”, dice Tjian, e attende con impazienza che i sostenitori della separazione di fase eseguano “effettivi esperimenti di discernimento”. Molti nel campo riconoscono che la sua cautela li ha spinti a essere piu esigenti nella loro scienza.
Tuttavia, una minoranza di ricercatori mantiene ancora il proprio scetticismo. Andrea Musacchio, biologo cellulare meccanicistico presso il Max Planck Institute of Molecular Physiology di Dortmund, in Germania, ha pubblicato all’inizio di quest’anno una feroce valutazione del campo10. Il quadro proposto da Pappu e Mittag “sostanzialmente spazza via l’intera letteratura sulla separazione di fase finora”, afferma. Molti ricercatori condensati affermano che la sua critica si basa su argomentazioni imperfette e una lettura incompleta della letteratura.
Pochi altri prendono il punto di vista severo di Musacchio. E come sottolinea il biofisico Josh Riback del Baylor College of Medicine di Houston, in Texas, e naturale che la comprensione scientifica maturi con il tempo. Quando si tratta di un concetto cosi nuovo, dice, “vuoi iniziare in modo semplice e poi aumentare la complessita”.
Goccioline di drogaggio
Nonostante i dibattiti nel mondo accademico, i cacciatori di droga stanno abbracciando il concetto. Societa biotecnologiche focalizzate sulla condensa come Dewpoint Therapeutics a Boston, Massachusetts, hanno raccolto collettivamente oltre 500 milioni di dollari dal 2019 e societa affermate hanno firmato accordi di partnership con start-up sulla condensa.
La maggior parte delle aziende interessate alla separazione di fase sta dando la priorita allo sviluppo di farmaci per il cancro e i disturbi neurologici, due classi di malattie spesso collegate a condensati che sono andati storto. A volte, questi condensati contengono proteine ​​​​tossiche e la manovra terapeutica piu semplice e dissolverle con farmaci o impedirne la formazione in primo luogo (vedi “Goccioline drogabili”).
Nella malattia dei motoneuroni (sclerosi laterale amiotrofica), ad esempio, molte mutazioni della malattia possono rendere i condensati piu viscosi del solito, portando a aggregati densi che sono un segno distintivo della condizione neuromuscolare degenerativa. Nel cancro, le proteine ​​che incoraggiano o sopprimono i tumori possono finire nei compartimenti sbagliati o ai livelli sbagliati, portando alla crescita del tumore.
Etern Therapeutics, con sede a Shanghai, in Cina, ha un farmaco candidato per il cancro nei primi studi clinici. La medicina sperimentale, denominata ETS-001, prende di mira un enzima associato al tumore. Come hanno dimostrato il co-fondatore e amministratore delegato dell’azienda Jidong Zhu e i suoi colleghi11, forme mutate di questo enzima si accumulano nei condensati, portando a una cascata di segnali che puo stimolare la crescita cellulare incontrollata. ETS-001 si lega all’enzima, bloccando la formazione di condensa e soffocando il tumore. Il mese scorso, Zhu e i suoi collaboratori hanno descritto un altro farmaco candidato per il cancro alla prostata che distrugge i condensati che si pensa renda tali tumori resistenti a determinate terapie standard12.
Altre malattie potrebbero richiedere una gestione piu attenta dei condensati. Il piu grande produttore di farmaci del mondo, Pfizer, con sede a New York City, sta lavorando con Dewpoint per sviluppare trattamenti mirati alla condensa per una forma di distrofia miotonica, una rara malattia genetica che colpisce i muscoli e altri sistemi corporei. In questa malattia, i condensati, che tendono ad accumularsi nelle posizioni sbagliate nelle cellule colpite, devono essere stabilizzati anziche distrutti.
Il punto di rugiada si concentra su altre malattie che richiedono anche questa sfumatura. Il biochimico dell’azienda Phi Luong e il suo team hanno lavorato su una malattia neurodegenerativa non rivelata e hanno scoperto che il nucleolo della cellula colpita, un denso condensato sferico nel nucleo della cellula dove si uniscono i ribosomi che producono proteine, assume una forma anormale nelle cellule malate. Rompere completamente il nucleolo ucciderebbe la cellula. Quindi l’obiettivo e trovare farmaci candidati con capacita piu sottili e riparative – “non quelli che sono solo una specie di mazza”, dice Luong.
E poiche molti farmaci tendono ad accumularsi nei condensati, i blob stessi potrebbero rappresentare una nuova strategia di rilascio, consentendo ai farmaci di concentrarsi nei siti d’azione desiderati.
In effetti, i condensati forniscono una via di mezzo tra le molecole bersaglio e le cellule intere. Sono un modo per comprendere le cellule “che in realta non si ottengono osservando i singoli elementi costitutivi”, afferma Tuomas Knowles, biofisico dell’Universita di Cambridge, Regno Unito, co-fondatore ed e chief technology officer di Transition Bio, con sede a Cambridge, Massachusetts.
Con un conteggio, centinaia, se non migliaia, di stati patologici potrebbero essere alimentati da meccanismi legati alla condensa13. “Non puoi guardare nessun sistema d’organo o qualsiasi malattia correlata senza considerare la possibilita che la mutazione patogena stia causando un condensato disregolato”, afferma Rick Young, biologo del Whitehead Institute di Cambridge, Massachusetts, e co-fondatore di Dewpoint, che, con i suoi coautori, ha pubblicato l’analisi a luglio.
“Non c’e un processo cellulare che e stato studiato che non e ora noto per coinvolgere i condensati”, dice Young. “Coinvolge dannatamente quasi tutto.”
